产品说明

        KEL-3000™ 是一种新型的阳离子脂质体转染试剂。适合于将核酸(DNA 和RNA)转染入真核细胞，具有低细胞毒性；对多种类型的细胞和培养板都具有高转染效率；转染时血清的存在不影响转染效率的优点。转染试剂在基因治疗中发挥着关键作用。用于将外源基因导入到目标细胞中。这些试剂经过精心优化以确保基因能够准确地定位到细胞内的特定位置，并稳定地表达所需的蛋白质。

       通过转染试剂的帮助，科学家们能够更有效地进行基因转移，从而加速基因治疗技术的发展和应用。在基因治疗领域，转染试剂的不断创新和优化，为治疗遗传性疾病、癌症等疾病提供了新的希望和可能。

适用范围

       贴壁细胞和悬浮细胞（哺乳动物细胞系）的转染。质粒要求:小于8000bp,超螺旋构型,A260/A280=1.8–2.0,内毒素<0.1EU/μg.

产品用途：

1. 生命科学研究：

1.1、基因功能研究：通过转染技术将外源基因导入细胞，可以研究该基因在细胞中的功能、表达调控、亚细胞定位等。这对于理解基因如何影响细胞行为、生物体发育和疾病发生具有重要意义。

1.2、基因敲除和沉默：通过转染技术导入含有特定基因敲除或沉默序列的质粒，可以研究特定基因的敲除或沉默对细胞生长、分化、凋亡等的影响。这对于揭示基因功能、探索疾病机制以及开发新的治疗方法具有潜在价值。

1.3、病毒感染研究：将病毒基因导入细胞系，可以研究病毒感染细胞的机制、抗病毒药物的作用机理等。这对于理解病毒致病机制、开发抗病毒药物以及制定有效的防控策略具有重要意义。

1.4、细胞分化和命运决定：通过转染技术导入与细胞分化命运相关的基因或调控元件，可以研究细胞的分化、凋亡、自噬等过程。这对于理解细胞发育、组织形成以及疾病发生中的细胞命运决定机制具有关键作用。

1.5、肿瘤研究：将与肿瘤相关的基因导入肿瘤细胞系，可以研究肿瘤细胞的恶性转化、肿瘤耐药性、肿瘤免疫等。这对于揭示肿瘤发生发展的机制、开发新的抗肿瘤药物以及提高肿瘤治疗效果具有重要意义。

2. 药物研发和生产：

2.1、疫苗生产：将病毒抗原基因导入合适的细胞系，通过转染技术获得可表达病毒抗原的细胞系，用于制备疫苗。例如，将病毒抗原基因导入昆虫细胞中，可以生产出高质量病毒疫苗。这对于预防和控制传染病具有重要意。

2.2、基因治疗：将治疗性基因（如治疗性siRNA、质粒DNA 等）导入靶细胞，通过转染技术实现基因治疗。例如，将特定基因导入心肌细胞中，可以治疗遗传性心脏病或心肌梗死等疾病。基因治疗为许多遗传性疾病和难治性疾病提供了新的治疗途径。

2.3、药物筛选：通过转染技术将药物靶点基因导入细胞系，可以用于筛选能够与药物靶点结合的药物候选物。这对于加速新药研发进程、提高药物筛选效率以及降低药物研发成本具有重要意义。

2.4、生产细胞系：在生产重组蛋白药物、抗体药物等过程中，通过转染技术将目的基因导入生产细胞系，可以获得可稳定表达目的药物的细胞系。这对于提高药物生产效率、降低生产成本以及保障药物质量具有重要意义。综上所述，转染技术在生命科学研究领域和药物研发、新药开发等领域具有广泛的应用前景。它不仅为研究基因功能、疾病治疗和新药开发提供了有效的工具和方法，还为揭示生命科学的奥秘和探索新的治疗途径奠定了坚实基础。

质粒DNA 的转染：

初次使用，建议进行剂量优化实验（不同DNA:试剂比例），来摸索最佳条件, 尤其是转染试剂的最佳用量!

对大多数细胞来说，DNA(µg)与KEL-3000™ (µl)的比例为1:2~1:3。转染时高的细胞密度可以得到高的转染效率和表达水平，并能减少细胞毒性。质粒要求：超螺旋构型，A260/A280 = 1.8–2.0，内毒素<0.1 EU/μg

1. 以24 孔板为例

贴壁细胞： 转染前一天，用500 µl 不含抗生素的培养基接种0.5～2×105细胞，使之第二天细胞融合度达到90%最合适。（融合度100%过高，培养基很快发黄，影响转染效率）

悬浮细胞：在准备DNA-KEL-3000™ 复合物之前，用500 µl 不含抗生素的培养基接种4～8×105细胞即可。

*在转染前1 小时，换37℃预热过不含双抗的完培800ul/孔（通常含FBS 5% ，此处血清不影响转染效率。但未预热的培养基会影响转染效率）。

2. 对每个转染样品，进行以下操作

a. 在Eppendorf管里分别加入50 µl Opti-MEM I Reclipped Serum Medium和0.8 µg DNA轻柔混匀(禁止涡旋)制成DNA稀释。

b. 在另一个Eppendorf管里分别加入50µl Opti-MEMI Reclipped Serum Medium和1.5～2.0 µl KEL-3000™ (注意用前先混匀)，轻柔混匀，制成KEL-3000™ 稀释液，室温静置5分钟。

c. 将DNA稀释液和KEL-3000™稀释液混合，轻柔混匀，室温静置20分钟， 形成DNA-KEL-3000™复合物。DNA-KEL-3000™复合物在室温下可稳定存在6小时。

3. 将DNA-KEL-3000™复合物加入到接种好的细胞中，将培养板轻轻地前后摇动，使复合物分散均匀。

4. 在37℃ CO2培养箱中培养4-6小时后更换以上预热的培养基,继续培养18～48小时。

5. 如果要筛选稳定细胞株，则在转染24小时后将细胞按照1:10或更高的比例接种到新鲜培养基中，第二天加 入选择性培养基进行筛选。

质粒DNA转染的优化 为达到最高的转染效率和降低细胞毒性的影响，可以对DNA和KEL-3000™的比例以及细胞密度进行优化，

一 般在1:0.5~1:5的范围内优化DNA (µg)和KEL-3000™ (µl) 的比例。

不同细胞培养板中转染时培养基、核酸及KEL-3000™ 用量

常见细胞的转染效率（荧光显微镜检测数据仅供参考，实验条件不同转染效率会有差别）

转染效率的测定方法

1)实时定量PCR检测;   2)Western Blot检测;   3)流式细胞术

4)荧光显微镜观察: 转染含有荧光蛋白基因质粒DNA，通过荧光显微镜观察荧光的强弱以及荧光的效率。

细胞转染注意事项：

细胞/DNA/siRNA 每次都不同，建议每次转染一定要进行预实验来摸索最佳条件，尤其是转染试剂的最佳用量！

1)转染试验失败原因：DNA/siRNA，转染试剂和细胞。转染效率低要先排除一下是否是siRNA的问题，如果siRNA无效，换再好的转染试剂也没意义，可以用带荧光标记的control siRNA做一下看看，转进去的话会有荧光的。确实转染效率低，可以考虑换转染试剂；毒性大则要减少转染试剂的用量。

2)细胞的种类和状态影响较大：转染时细胞必须处于良好生长状态，转染时细胞的密度一般铺板率在达到70—80%最好（此时细胞处于对数生长期）；

3)如果是贴壁细胞，应保证贴壁在12～24小时在进行转染，否则细胞转染容易脱壁。对于贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。

4)质粒的大小，质量和用量对转染效率很关键。质粒要求:小于8000bp,超螺旋构型,A260/A280=1.8–2.0,内毒素<0.1EU/μg.

5)转染时注意脂质体和用量，过量的话对细胞毒性大也容易失败。

6)转染作用4～6小时一定记得要换含血清的培养基，以降低毒性。

7)培养基以及洗涤细胞和稀释用的培养基要无血清、无双抗。

8)转染试剂对个别细胞可能有一定毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养答基中添加抗生素。

9)高纯度的DNA或RNA可获得较高的转染效率！用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD 260/280比值应在1.8以上。血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故用无血清培养基转染效果更好！

10)培养基中的血清：在开始准备DNA和转染试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。其实，只要在DNA-转染试剂复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。

11)培养基中的抗生素：抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。

12)一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。

13)如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。

14)建议设置阳性对照和阴性对照。

15)不推荐用于：原代细胞（例如：Primary Hepatocytes）、神经元细胞（例如：Primary Neurons）、干细胞（例如：iPSCs）或高度敏感细胞（例如：MSCs，T cells，Dendritic Cells）。

如何提高细胞转染效率和细胞存活率？

高效低毒的细胞转染 = 匹配的转染试剂+ 健康的细胞状态 + 适配的培养条件+ 高质量的核酸。

一、转染试剂：细胞转染的“关键工具”

转染试剂是负责把核酸安全、高效地送进细胞，是转染成功的最大保障。

关键注意要点：

1.试剂适配：

不同核酸（DNA/RNA）、不同细胞，适配的转染试剂不一样。比如难转细胞（如Jurkat 细胞），可以选用专用Lipo 转染试剂盒，效率会大幅提升。

1.1 按细胞类型选择适配试剂

1）易转染细胞（HEK293、HeLa 等）：增殖快，用基础型转染试剂即可。

2）较难转染细胞：内吞能力偏低、对毒性敏感，优先选温和高效的脂质体试剂。

3）难转染细胞（Jurkat、THP-1 等）：增殖慢、内吞极弱、高敏感，建议选用富百科KEL-3000™ 和KEL-3000™3000，可以大幅度

提升转染效率。

1.2 转染试剂的核心作用

转染试剂直接影响脂质体-核酸复合物的稳定性、递送效率、内体逃逸效果，同时决定与细胞的适配性及对细胞的毒性，最终综合决定转染效率。

2. 配比优化：

核酸和转染试剂的比例要合适——比例太低，复合物不稳定，难进入细胞；比例太高，会增加细胞毒性，导致细胞死亡。

二、细胞自身：转染成功的“基础前提”

细胞自身状态的好坏，直接决定了它“接收”外源核酸的成功前提。这是最容易被忽略，但最关键的前提！

关键注意要点：

1. 细胞活性： 转染前细胞活性要高，并且没有支原体、细菌等污染。

2. 生长阶段： 优先用“对数生长期”的细胞（分裂活跃、代谢旺盛）；避开静止期、衰亡期细胞（活性低，再努力也难转染）。

3. 细胞密度：密度均要适中。太密会抢营养，太稀则生长不良，都会拉低转染效率。

4. 传代次数： 大部分细胞传代≤30 代，有些细胞要≤10 代（如HUVECs 人脐静脉内皮细胞）！

三、培养条件：培养细胞和转染细胞的细节，往往是实验成败的分水岭。

关键注意要点：

1. 培养基需适配：用细胞专用的培养基，优先新鲜配制。

2. 血清用对时机：核酸转染：复合物形成阶段不能加血清（会干扰复合物形成）；

建议固定血清品牌批次，选用低内毒素胎牛血清。其具体影响可详见细胞转染效率的隐形绊脚石：血清干扰，巧选培养基化解

3. 抗生素不乱加：瞬时转染时，转染体系里不能加抗生素；稳定转染要等48-72 小时后，再加入抗生素筛选。

四、核酸质量：转染的“核心材料”

外源核酸（DNA/RNA）是转染的“主角”，质量不达标，再完美的操作也白搭。

关键注意要点：

1. DNA 质控：高纯度、无杂质、无内毒素；建议A260/A280≈1.8，A260/A230=1.8–2.0。

2. RNA 质控：分子结构完整，实验环境及耗材需RNase-free，防止降解导致转染无效；建议 A260/A280≈2.0，A260/A=1.8–2.0。

Lipo 转染细胞死亡率高原因排查：

1. 细胞状态问题（最基础和关键的环节）

1.1）细胞状态不佳：转染前细胞本身就不健康（如传代次数过多、生长缓慢、形态异常），转染过程会加剧其死亡。确保转染时细

胞处于对数生长期，活力旺盛（>90%）。

1.2）细胞密度不当：

· 密度过低：细胞间没有足够的接触和支持，更容易受到转染试剂的毒性影响。

· 密度过高：细胞进入接触抑制状态，分裂变慢，转染效率会显著下降，且容易导致毒性积累。请严格按照您使用的转染试剂和细胞类型的推荐密度进行铺板。

1.3）支原体污染：支原体污染会严重改变细胞的代谢和生理状态，使其在转染压力下极易死亡。定期对细胞进行支原体检测。

2. 转染试剂与复合物毒性

2.1） 转染试剂本身毒性：不同转染试剂（特别是阳离子聚合物和脂质体）有不同程度的细胞毒性。

2.2）复合物比例不当：

· DNA/RNA 与转染试剂比例不当：比例过高会导致形成过大、带正电过多的复合物，这些复合物会破坏细胞膜，导致死亡。

· 复合物总量过多：加入的复合物总体积或总量过大，超过了细胞的承受能力。

2.3）复合物孵育时间过长：将复合物与细胞共孵育的时间太长（如超过24 小时），会持续对细胞产生毒性。通常6-8 小时后更换新鲜培养基可以极大地缓解毒性。

2.4）复合物制备不当：未使用无血清培养基稀释试剂和DNA，或混合顺序、涡旋力度不当，导致形成过大或不稳定的复合物。

3. 外源DNA/RNA 的质量与数量

3.1）DNA质粒质量差：制备的质粒含有内毒素、蛋白质、RNA或盐分残留，是导致细胞死亡的常见元凶。使用去内毒素的高纯度质粒提取试剂盒。

3.2）DNA/RNA 用量过高：过量的外源核酸会加重细胞的代谢负担，并可能引发强烈的天然免疫反应（尤其是对于RNA 转染）。

进行剂量梯度实验，找到最佳用量。

3.3）基因产物本身的毒性：您要表达的蛋白本身可能对细胞有毒性（如促凋亡蛋白、离子通道蛋白、某些酶等），导致表达该蛋白的细胞死亡。

4. 转染操作过程

4.1）换液操作过于剧烈：在转染前换液或转染后换液时，吹打力度过大，直接将细胞吹落。

4.2）复合物加入方式：将复合物直接滴加到培养基中，而没有均匀滴洒，导致局部浓度过高。应缓慢、均匀地滴加到培养基的不同区域，并轻轻摇动培养皿使其混匀。

4.3）使用了抗生素：在转染培养基中加入青霉素、链霉素等抗生素，会大大增加转染试剂的细胞毒性。转染全程必须使用无抗生素的培养基。

总结建议：

1. 检查细胞状态，确保健康且密度合适。
2. 设立Mock 转染对照，这是判断毒性来源的“金标准”。

3. 确认质粒无内毒素，且转染过程中未使用抗生素。4. 优化DNA/试剂比例并缩短孵育时间。

转染不成功原因：

通常由细胞状态、核酸质量、转染试剂选择不当或操作细节失误导致。以下是系统性原因分析与解决方案：

一、细胞相关因素

1.1细胞状态不佳：

处于对数生长期的细胞转染效率最高，静止期或老化细胞摄取能力下降。

建议：转染前确保细胞活力 >90%，贴壁细胞汇合度控制在 70%-90%，悬浮细胞密度为 5×10⁵–2×10⁶ 个/mL。

1.2细胞污染或传代次数过多：

支原体、细菌污染会显著降低转染效率，且难以察觉。

长期传代导致遗传变异，影响表达稳定性。

建议：定期检测支原体，使用低传代（<30次）细胞进行实验。

1.3 细胞类型本身难转染：

原代细胞、神经元、干细胞等比HEK293、HeLa等常规细胞系更难转染。

解决方案：尝试电穿孔、病毒载体或专用转染试剂（如Lipofectamine 3000用于难转细胞）。

二、核酸质量问题

2.1纯度不足：蛋白质、DNA、有机溶剂残留会影响转染复合物形成。检测方法：样品 A260/A280 应在 1.8–2.0，A260/A230 >2.0

2.2核酸降解：RNA 易被 RNase 降解，需全程使用无酶耗材。检测方法：琼脂糖凝胶电泳观察 28S/18S 条带是否清晰。

2.3内毒素污染(尤其质粒DNA): 内毒素可引发细胞毒性，导致死亡或转染失败。建议：制备高纯度DNA。

三、转染试剂与复合物制备

3.1试剂选择不当: 不同细胞类型需匹配不同试剂：HEK293、HeLa适合Lipofectamine 3000转染；

siRNA 转染用RNAiMAX； 原代细胞用JetPEI 或电转

3.2 复合物比例与稳定性差：

转染试剂与核酸比例需优化，过高毒性，过低效率低。建议:按说明书配比，在无血清培养基中形成复合物，室温孵育15–20分钟。

3.3试剂毒性大: 高浓度试剂引起细胞凋亡。建议：通过 CCK-8 或 MTT 法预实验确定最低有效剂量。

四、操作与环境因素

4.1转染时机不当

转染后 4–6 小时应更换为完全培养基，去除残留试剂以减少毒性。

检测时间：DNA 转染后 48–72 小时检测蛋白表达；siRNA 在 24–72 小时检测沉默效果。

4.2培养基含抗生素或血清干扰: 脂质体转染时避免使用抗生素，可能增强毒性。复合物配制建议用无血清培养基(如Opti-MEM)

4.3无菌环境与物理参数: 细菌/真菌污染会间接影响转染效率。 温度、湿度波动影响细胞状态，应在稳定环境中操作。

Lipo 转染试剂用于不同细胞转染时用量参考（以96 孔板为例）