腺相关病毒使用说明 一、交付 

* 表中时间为平均交付时间，最终以项目评估时间为准。
* 赠送 20μl 对照病毒（一般为空载或带荧光标签病毒，其他特殊对照需要定制）。
* 交付病毒已做超纯化处理。

二、 运输

交付的 AAV 病毒将存储在 PBS 缓冲液中，并采用干冰运输。收到病毒后，如遇到包装破损等问题，请及时与我们的工作人员联系。

三、保存与处理

1. 收到病毒后， 如实际使用量较少， 可将病毒小量分装（请用 DNase/RNase-Free 无菌耗材 进行分装，并用封口膜进行封口保存） 。放置于 -80℃保存，可保存约一年； -20℃可保存 2-3周； 4℃可保存 1-2 周。病毒保存一年后，请进行滴度检测后再使用。
2. 病毒可用无菌 PBS 或无菌生理盐水进行稀释，请尽量按照实际使用量现稀释现用。
3. 病毒使用前，请冰浴融化，并在整个实验过程中将病毒置于冰上操作。未使用完毕若存放于4℃,请尽量在一周内用完。
注意：虽然 AAV 病毒比其他多数病毒稳定（如慢病毒），但是也请避免反复冻融，否则将会导致病毒滴度显著下降。

四、安全须知

1. 病毒使用前，操作人员应当充分了解病毒相关实验安全问题，加强安全操作意识。在实验操作中，请务必穿戴好实验服、口罩、护目镜以及一次性手套。
2. 建议按照 BSL-2（Biosafety Level-2，生物安全防护二级水平）规范在 Class II 生物安全  柜中进行病毒操作（如在超净工作台中进行操作， 请勿打开排风机， 避免病毒与外界环境接触） 。
3. 病毒操作时，请注意避免蛋白酶或细菌污染，请使用 DNase/RNase-Free 耗材进行操作。
4. 若眼睛、皮肤等不小心接触到病毒，请立即用大量清水冲洗；若病毒接触到伤口等部位，请立即用 10% 碘伏溶液擦洗之后，用大量清水冲洗，冲洗时间建议至少 20min。
5. 实验结束后，请用新配制的 1% 的次氯酸钠溶液消杀病毒至少 20min；也可采用 2% 的戊二醛溶液或 0.25% 的 SDS 溶液进行消杀处理，还可采用高温高压（121℃,   1h）消杀措施。
6. 实验结束后，请及时用大量肥皂水清洁双手。所有生物废料的处理均需遵从公共机构发布的和所处机构制定的规范条例执行。

五、体外应用

病毒滴度（Titer）是指单位体积病毒液具有活性的病毒单位数量， 是衡量病毒质量的核心指标。 AAV 滴度单位是 vgs（基因组拷贝数，  vector genomes）/ml。
感染复数（Multiplicity of infection ，MOI） 是指感染时病毒和细胞数量的比值，即 MOI  =  （病毒滴度 x 病毒体积）  / 细胞数目。细胞最适 MOI 是指在实验中将某种细胞感染达到 80%  时的 MOI。对于 AAV，MOI 单位是 vgs/cell。不同 AAV 血清型的细胞感染 MOI 存在较大差异。 一般 AAV1 和 AAV2 两种血清型较易进行体外细胞感染，而其它血清型的最适 MOI 一般高达  103-105vgs/cell。

五、体内应用（以小鼠为例）

由于体内各组织器官的结构和分布各异，因此 AAV 感染方法也不尽相同，现总结常用的几种AAV 体内应用方法供参考。AAV 体内应用方法供参考。

 脑立体定位注射（适用于全脑 / 局部脑区）

1. 动物及材料准备
小鼠（至少 6 周龄） 、脑立体定位设备、冰浴融化的病毒液、麻醉液（例如 1% 戊巴比妥钠）  、常用手术器械及消毒液（例如碘伏、 75% 乙醇） 、微量注射器、术后保暖装置等动物手术相关准备材料。
2. 小鼠麻醉及术前处理
将小鼠进行称重，按照一定剂量标准对其进行腹腔注射麻醉液，接着放置于饲养笼中。待小鼠完全麻醉后，用剃毛器将小鼠头部毛发剔除干净。
3. 病毒吸取及调试
用无菌生理盐水冲洗病毒微量注射器 3-5 次， 确保畅通，  最后一次将注射器内生理盐水排干净。 将吸取适量病毒后的注射器固定于脑立体定位仪上，并连接上微量注射泵（事先可吸取少量病毒，以测试注射器是否可以顺畅排出病毒）。
4. 小鼠固定
将小鼠置于脑立体定位仪上，先将小鼠门齿卡在适配器门齿夹上，轻轻压上门齿夹横杆，调整  适配器高度和前后位置，使耳杆可以方便地进入外耳道。将一侧耳杆插入小鼠耳道并固定，接  着将另一侧耳杆插入耳道，  调整两侧耳杆使得小鼠头部保持在中心位置，  再依次固定两侧耳杆， 并锁紧门齿夹。最后的固定效果应为：小鼠鼻部处于中心位置，头部固定，提拉尾部也不掉，同时小鼠头顶平面与地面平行。
5. 病毒注射
小鼠固定好后，依次用碘伏和 75% 乙醇对其头顶皮肤进行消毒，沿中间位置剪开头皮（不超  过 1cm） ，去除颅骨表面结蹄组织，暴露出前囟、后囟，将微量注射器针头置于前囟位置后坐  标归零，根据目的脑区位置的纵横坐标找到颅骨表面下针点并做标记，并用颅骨钻小心清磨颅  骨，用注射器针头小心挑开颅骨（防止扎到脑组织） ，然后将注射器针头经颅骨钻孔处垂直插  入脑内目标脑区位置，  启动注射泵，  开始注射病毒（根据脑区大小及病毒滴度确定注射速度）  。 注射完成后，请留针 5-10min，随后缓缓抽出注射器针头，浸泡在无菌生理盐水中，保持针头湿润状态。
6. 小鼠恢复
用医用缝合线缝合小鼠头部皮肤，再用碘伏对创口及其附近皮肤进行消毒。随后将小鼠从脑立  体定位轻轻取下，放置于干净的饲养笼内（可于手术前更换干净的饲养笼） ，置于温暖的房间  内进行恢复 2-3 周，恢复期间注意观察小鼠头部伤口的愈合情况及其生命体征， 对于死亡的小鼠，请及时从饲养笼中清理掉。
注意：
a. 动物脑立体定位病毒注射具有高精度的特点，故在正式病毒注射实验之前，可注射染料等进行预实验。
b. 动物脑立体定位时，  前后囟位置需确保在同一水平面上，  两点连线左右相同距离的点也要处在同一水平面，  以保障动物脑区定位的准确。
c. 全程实验操作时，动作务必轻柔，切忌盲目用力等暴力操作，避免造成动物脑部组织损伤。

尾静脉注射（适用于肝脏、血管等全身大部分器官）

1. 动物及材料准备
小鼠、小鼠固定设备、冰浴融化的病毒液、  1ml 注射器、酒精棉球、生理盐水或 PBS 等。
2. 小鼠固定
提取小鼠尾巴，将其放在鼠笼盖或手臂上，并进行适当安抚，然后将小鼠装入固定器中，盖紧盖子，并使其尾巴外露，用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，也可以采用加热等方式，使其血管扩张。
3. 病毒注射
用生理盐水或 PBS 将病毒稀释至合适滴度，并控制病毒注射体积在 100-200μl，用注射器吸 取病毒 100-200μl，随后拉直小鼠尾巴至其红色静脉清晰可见，在距尾尖 1/3 处进针，缓缓注
入病毒后拔出，并用干净棉球按压注射位点 1-2min，直到不再出血。
4. 小鼠恢复
将小鼠从固定器上取下，放回原饲养笼中恢复。恢复期间，注意观察小鼠的伤口愈合情况及生命体征，对于死亡的小鼠，及时从饲养笼中清理掉。

眼部（玻璃体腔）注射（适用于眼）

1. 动物及材料准备
小鼠、冰浴融化的病毒液、麻醉液、微量注射器、酒精棉球、碘伏、红霉素眼膏、冷光源、取暖装置等。
2. 病毒注射
小鼠称重后按照一定剂量标准对其进行麻醉处理，并在其眼部及其附近皮肤做好消毒处理，并  涂抹红霉素眼膏以保持眼部湿润。用微量注射器吸取适量病毒，  将完全麻醉的小鼠置于台面上， 并给予单一冷光源照射。按住头部，稍用力使小鼠眼球部分突出，避开血管位置，将注射器自  角膜后缘 1mm 位置插入玻璃体腔内，针尖先垂直进入，随后倾斜，慢慢推注病毒（一般每只眼 1-3μl）。病毒注射完毕后，缓缓抽出针头。
3. 小鼠恢复
将小鼠放回原饲养笼，可置于温暖的房间待其恢复。恢复期间，注意观察小鼠伤口的愈合情况及生命体征，对于死亡的小鼠，及时从饲养笼中清理掉。

腹腔注射（适用于脂肪、肌肉、肠道等全身器官）

1. 动物及材料准备
小鼠、冰浴融化的病毒液、注射器、取暖装置等。
2. 病毒注射
注射器吸取适量病毒，  冰上备用。提取小鼠尾巴，  将其放在鼠笼盖或手臂上，  并进行适当安抚。 随后抓取小鼠，用拇指和食指捏住小鼠颈背部，用无名指及小指固定其尾部和后肢，确保小鼠  躯体舒展且不能乱动，翻转小鼠使得小鼠头部朝下，手持注射器在下腹部离腹白线约 0.5cm  处下针，使得针头与小鼠腹部大约形成 30℃夹角，刺入腹部， 此时调整针头方向约与小鼠腹  部平行，缓缓进针。针头进入适当距离后，缓缓注射病毒，病毒注射完毕后稍作停留， 并慢慢
旋转拔出针头，以避免漏液。
3. 小鼠恢复
将小鼠放回原饲养笼，  可以放置于温暖的房间，  待其恢复。恢复期间，  注意观察小鼠生命体征，对于死亡的小鼠，及时从饲养笼中清理掉。

滴鼻注射（适用于呼吸系统）

1. 动物及材料准备
小鼠、冰浴融化的病毒液、麻醉液、移液器、取暖装置等。
2. 病毒注射
小鼠称重后按照一定剂量标准对其进行麻醉处理。待其完全麻醉后，用手捏住小鼠背部皮肤， 并用拇指和食指夹住头颈部皮肤来固定头部，翻转手腕使小鼠腹部朝上，保持身体舒展，头部 向上，身体与水平面呈 45℃角，并用另一只手捂住小鼠嘴巴，食指弯曲压在小鼠鼻骨上方。 用移液器吸取适量病毒，将移液器尖端置于小鼠鼻孔处并与之呈 90℃角，再缓慢地将病毒逐滴注入小鼠鼻孔（保证滴注过程中小鼠不打喷嚏） ，一侧鼻孔滴注一半体积之后， 更换另一鼻孔。
3. 小鼠恢复
病毒滴注结束后，将小鼠放回原饲养笼， 可以放置于温暖的房间，待其恢复。恢复期间，注意观察小鼠生命体征，对于死亡的小鼠，及时从饲养笼中清理掉。

  表 1  不同注射位点推荐 AAV 注射体积与剂量

表 2  提供 AAV 类型 - 血清型

不同血清型 rAAV 的衣壳蛋白识别的细胞表面的受体不同，具有一定的器官靶向特异性。利用这个特点，对特定血 清型 rAAV 衣壳蛋白 Cap 基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染性的 rAAV 载体。提供 不同血清型的 rAAV，具体如表格所示 :

表 3  提供 AAV 类型 - 启动子

根据客户需求选择相应靶向性的 rAAV 血清型。如果仅需要在某个部位表达，可以选择特异性的启动子。